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        植物组织培养中污染的来源

        ?作者: 组培设备 发布时间:2019-04-09 14:41?? 浏览次数:

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        植物组织培养污染主要是由霉菌、细菌、酵母菌引起的污染。菌类传播途径有户外风传播、涡流传播、接种传播,不正确操作也会增加污染概率,如灭菌不够、操作过慢,另外还有内生菌造成的潜伏性污染。有些植物上昆虫、螨虫的体表带有霉菌的孢子、细菌,在9—10月份是重要污染源,此时大量昆虫造成的污染源最易造成组织培养污染的严重发生。

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        植物组织培养中污染的防治

        1 细菌污染

        1.1 细菌污染定义 细菌是处于生物和非生物之间的微生物。从形态上看,细菌可以分成球菌、杆菌、螺旋菌等3类。土壤、水、城市空气里都有细菌散布,种类达50种以上。

        细菌污染是指在培养过程中,在培养基表面或材料表面出现黏液状物体、菌落或浑浊水迹状物质,有时甚至出现泡沫发酵状物质。细菌污染又以芽孢杆菌污染最普遍、最严重,这种芽孢杆菌能耐一定高温、高压,对消毒剂和紫外线也有一定抗性,常由于高压灭菌不彻底造成污染。细菌性污染主要是工作人员使用了未经充分消毒的工具如剪刀、镊子、三角瓶等,或是由呼吸排出的细菌,有时操作人员用手接触材料或器具边缘,使微生物落入培养基中,有时也会因剪取带菌材料后没消毒,用具又未彻底灭菌,极易造成污染。另外,由于组织培养室面积大、易污染,室内温度高,空气湿度大,菌类繁殖旺盛也会加重污染。

        1.2 细菌污染防治 为了实现低污染率,在组织培养中除采用常规技术措施之外,还针对性地在培养基中加入杀菌剂如抗生素??股刈饔迷恚呵齑竺顾?、链霉素属于氨基糖苷类型,其与细菌中的30S核蛋白体亚单位结合,抑制细菌的油酸甘油酯合成,通过阻断其代谢途径使微生物致死。但抗生素也可能抑制植物组织的叶绿体和线粒体蛋白质的合成,导致植物叶片变小或变黄,而且高浓度抗生素会影响植物生长。在培养基中添加抗生素,选择合适浓度非常关键,浓度低时效果差,浓度高时又容易对植物产生毒害,影响增殖或使培养材料变黑,出现死苗、白化苗等。

        将2种及其以上的抗生素结合使用,可以防治细菌的抗药性。在绿巨人组织培养研究中探讨了青霉素、先锋霉素、庆大霉素对继代培养中细菌污染的抑制效果,指出先锋霉素的抑菌效果最好,青霉素和庆大霉素次之;研究发现,链霉素能防治长春蔓芽继代培养中出现的细菌。但也有报道发现,多数情况下使用抗生素只能抑制细菌生长而不能将其杀死,抗生素浓度太高对植物有一定毒害作用,而且抗生素一般不稳定,遇酸、碱或加热易分解而失去活性,这些问题使抗生素的使用受到限制。因此,寻找稳定、耐高温和高压的理想抗生素成为控制细菌污染的一个重要课题。

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        2 真菌污染

        1 真菌污染定义 真菌是一类没有叶绿素、异养的真核微生物。室内真菌种类主要有芽枝孢霉属、曲霉属、铰链孢霉属、镰刀霉属、青霉属等。真菌以腐生、寄生或共生的形式进行营养性生活。真菌数量与温度、湿度有很大关系。春季、夏季尤其是南方的梅雨时节,温暖潮湿,非常适合真菌生长。冬季室内真菌浓度较高,如果长期使用空调而不注意通风,可引起室内真菌污染加重。真菌污染出现很快,一般接种后3~5 d 就发现菌丝,继而很快出现黑、白、黄、绿等孢子。真菌污染一般是由空气污染、瓶口边缘和取放封口纸扬起的灰尘、真菌孢子落入器皿中造成的。

        2 真菌污染防治 常用的灭菌剂有70%乙醇、0.1%~1%氯化汞、3%~10%过氧化氢、1%~10%的漂白粉滤液、0.5%~10%次氯酸钠溶液、4~50 mg/L 抗生素。70%乙醇杀菌效果好,有润湿作用,能排除外植体表层组织的空气,但穿透力强,应严格控制灭菌时间;氯化汞对外植体表面的灭菌效果最好,但残留的重金属汞难以去除,其毒害作用在培养一段时间后才能表现出来,因此灭菌后要将材料冲洗干净;过氧化氢分解后生成有杀菌作用的氧气,无毒害;漂白粉杀菌效果很好,但须避光、干燥贮存;次氯酸钠可分解生成有杀菌作用的氯气而挥发;抗生素可用来去除材料内部组织所带菌类,但抑菌类型单一、药效时间短、稳定性差,容易使菌类产生抗药性,浓度高时影响植物生长,使其应用受到限制。为使灭菌剂能润湿整个组织表面,可在灭菌剂中加入数滴润湿剂吐温-80或吐温-20,可起到良好的灭菌效果。

        严格执行无菌操作,定期用甲醛及高锰酸钾熏蒸对组织培养室消毒。每次使用组织培养室或超净工作台时,先用紫外灯杀菌20~30 min,再用75%乙醇喷雾降尘。接种时用75%乙醇的棉球擦拭培养瓶外部,然后再放入超净工作台;接种时瓶子要放成45°角,放在火焰上方,利用气流上升原理,以防止空气中的孢子落入瓶内,取封口纸时动作要轻。另外,如发现霉菌污染应及时清除。对于外地引进的试管苗,运输过程中瓶口及封口纸往往积灰尘和孢子,应仔细用75%乙醇擦拭,接种时再烧瓶口,否则容易造成污染。为防止刚引进的材料、刚获得的无毒材料以及珍贵材料受到污染,用小培养瓶培养,每瓶转接1芽,虽然培养瓶数量增加,但这是防止稀缺材料污染损失的最有效途径。

        有关抗生素消除细菌的研究较多,但目前对酵母菌污染的研究相对较少,Poulsen等在苹果分裂组织微生物消除的研究中,测试了几种物质对酵母菌的毒性,虽然这些物质对植物材料都没有伤害,但没有一种物质能够消除酵母菌。胍类化合物是唯一对2种酵母菌有毒的复合物,但它对分裂组织有毒害作用。霉菌污染的一个重要特点是迅速、难控制。目前关于真菌污染的研究还很少,有人建议用防腐剂去除真菌污染,但有关研究尚未见报道。

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        另外,培养基中存在有机物是污染产生的重要原因,去除有机物也是减少污染的一条途径。在阿月浑子组织培养的研究中,除去培养基中的VB1、VB6、烟酸等有机成分(保留肌醇),经2~3代培养后,能抑制细菌生长,对丛生芽生长增殖没有影响。原因是这些有机成分是某些细菌生长的必需物质,除去这些有机物后,细菌无法生长发育而逐渐死亡。日本古在丰树首创的植物无糖组织培养快繁技术则完全除去了培养基中的有机成分,输入可控制量的CO2气体作为碳源,并通过控制环境因子,促进植株光合作用速率,使之由异养型转变为自养型,因而植株长势良好,污染率明显降低。由于去除了糖,组织培养苗由玻璃瓶内培养改为箱式大容器培养,也可将整个培养室作为培养容器,甚至不需要严格的无菌操作,也极少被污染,这项技术至少在许多植物组织培养苗的促根阶段应用比较成功。

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