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        蒜头果组培褐化控制技术研究

        ?作者: 组培设备 发布时间:2019-08-17 15:36?? 浏览次数:

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          蒜头果Malania oleifera为铁青树科Olacaceae蒜头果属常绿乔木,为我国特有的二级?;ぶ参?,2013年被列为极小种群野生植物物种,目前仅有 1.5万余株野生植株零星分布于我国云南与广西的狭长区域。蒜头果果实富含油脂,其中神经酸(二十四碳烯-15-酸)相对含量高达 67%。神经酸可促进神经细胞发育和生长,并对改善记忆、心血管疾病、抗疲劳、防止神经衰弱等具有良好的药理功效,是倍受青睐的保健品添加剂,同时是合成麝香酮的理想原料(麝香酮是天然麝香的主要成分且含量仅为2%),具有较好的产业开发价值。

          植物组织培养技术对挽救蒜头果处境及产业化开发具有重要意义。目前,对蒜头果的组织培养已有报道,但有关褐化现象的研究少见报道。本研究利用正交试验设计,分析蒜头果组培中的褐化问题,并对其褐化控制措施进行探讨。

          1 材料与方法

          1.1 材料

          蒜头果外植体来源于云南山里红生物科技有限公司种质资源圃(广南),为3~5年生实生苗。

          1.2 方法

          采集枝条作为外植体,去除叶片保留叶柄,裁成所需的材料类型(详见1.3),然后流水冲洗1 h,再用洗洁精摇晃清洗5 min,在超净台上消毒,无菌水充分清洗,无菌滤纸吸干。切除0.5 cm伤口,将材料切为含1~2个腋芽的两段,茎段长1.5~2 cm,接种至培养基,每瓶接种1个茎段,每处理30瓶。培养条件光照 2000~3000 lx,光照周期8 h·d-1,温度(25±2) ℃。培养至第7 天观察外植体褐化情况,并计算褐化率和获得率,褐化率为褐化株数占接种总数百分比,获得率为未污染未褐化株数占接种总数百分比。采用SPSS 21.0进行数据分析。

          1.3 L9正交试验设计

          1.3.1 消毒方式 设三种消毒方式:75%乙醇处理30 s,再用0.1%升汞(HgCl2)处理10 min;2%次氯酸钠(NaClO)处理15 min;0.1% HgCl2处理6 min+2% NaClO处理10 min (表1)。

          1.3.2 外植体 6月下旬至7月上旬,取长8~12 cm腋芽饱满的当年春季新梢,裁为三段,每段含腋芽2~4个,长3~4 cm,分为茎梢、幼嫩、半木质化三种类型进行正交试验。

          1.3.3 抗氧化剂 培养基中分别按添加2 g·L-1聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、添加200 mg·L-1抗坏血酸(VC)和添加300 mg·L-1硫代硫酸钠(Na2S2O3)三种抗氧化剂安排正交试验。除添加抗坏血酸的培养基采用过滤灭菌,其他均为高压蒸汽灭菌。

          1.3.4 培养基 分 3种基本培养基安排正交设计,分别为 1/2MS、1/2WPM、1/2DKW。培养基均添加2.0 mg·L-1 6-BA、0.1 mg·L-1 NAA、糖 30 g·L-1、琼脂 6 g·L-1、活性炭 1 g·L-1,pH=5.5。

          表1 正交试验设计因素与水平

          

         

          2 结果与分析

          2.1 正交试验分析

          由表2可知,极差R依次为B>C>A>D,即影响蒜头果外植体褐化的因素按主次排序为外植体>抗氧化剂>消毒方式>培养基;各因素最优水平组合为A3B3C1D1,即采用当年生靠近新梢末端半木质化部位作为外植体,通过0.1%升汞6 min + 2%次氯酸钠10 min消毒,在含有PVP 2 g·L-1的1/2WPM培养基上培养能较好地减少褐化产生。

          由获得率可知,极差R依次为B>C>A>D,说明影响蒜头果无菌苗获得的因素按主次排序为外植体>消毒方式>培养基>抗氧化剂;各因素最优水平组合为A3B3C1D1,即最佳的提高获得率的方法为采用当年生靠近新梢末端半木质化部位作为外植体,通过0.1%升汞8 min + 2%次氯酸钠 10 min消毒,在含有 2 g·L-1 PVP的1/2WPM培养基上培养。

          减少褐化率和提高获得率的各因素最优水平组合均为 A3B3C1D1,表明影响褐化率和获得率的主要因素为外植体类型。

          2.2 方差分析

          褐化率方差分析见表3。根据F值,因素B对褐化率影响最大,达极显著水平,因素A、C、D的影响未达显著水平,即影响蒜头果组培褐化的因素中,外植体类型的影响最显著,是褐化的最主要因素,与直观分析结果一致。

          表2 L9(34)正交试验设计与结果

          

         

          注:括号内为获得率的统计;数据统计于接种后7 d。

          表3 方差分析和多重比较

          

         

          注:F(2,2)0.01=9,F(2,2)0.05=19;*为显著,极为显著。不同小写字母表示差异达0.05显著水平,不同大写字母表示差异达0.01极显著水平。

          差异显著性分析表明,外植体类型中,各水平间对褐化率的影响呈极显著差异,茎梢褐化率最高,达81.10%;半木质化材料最低,为17.78%。消毒方式、抗氧化剂和培养基类型各水平间对褐化率的影响均无显著性差异。上述结果说明,选择半木质化枝条作为外植体是控制蒜头果褐化最有效的途径。

          获得率与污染率、褐化率有关,褐化率越低,污染率越低,则获得率越高。根据获得率方差分析的F值,因素A的影响最大,达显著水平,即消毒方式对获得率具有显著影响。外植体、培养基、抗氧化剂等因素的影响均未达显著水平,3因素各水平间获得率也无显著差异。

          3 结论与讨论

          在植物组织培养中,一般通过选择适当的外植体、消毒方法、培养基和生长调节剂,控制培养温度和光照,培养基中添加抗氧化剂和碳粉,加快继代转瓶速度等综合手段防止褐化。本研究中,影响蒜头果组培褐化的最主要因素是外植体类型和抗氧化剂类型。因此,降低褐化率首要考虑蒜头果外植体部位,试验表明以当年生枝条半木质化材料最佳;其次是选择合适的抗氧化剂种类和浓度,本试验中,添加VC、Na2S2O3、PVP均能在一定程度上降低褐化率,以2 g·L-1 PVP最佳,这与刘兰英的结论一致;最后考虑外植体消毒方法。培养基类型对蒜头果褐化的影响较小,可不予考虑。综上,在蒜头果组织培养中,控制褐化并提高获得率的最佳方法为采用当年生半木质化新梢为外植体,经0.1%升汞6 min + 2%次氯酸钠10 min消毒,用含有2 g·L-1PVP的1/2WPM培养基培养。

          褐化、污染和玻璃化是植物组织培养的三大难题,是决定组织培养成功与否的关键,本试验发现,蒜头果外植体的褐化发生较早,接种后24 h便有褐化产生,72 h后大部分已经褐化。因此,控制培养期间的温度和光照,加快继代转瓶速度,调整植物生长调节剂配比等手段在蒜头果组织培养上均不适用。蒜头果组培褐化的控制应着重考虑外植体的选择,另外辅助使用适宜的抗氧化剂。此外,蒜头果枝叶中富含苯甲醛、苯甲醇,褐化外植体的伤口常产生橙黄色液滴。因此,外植体取材前黑暗处理,取材后预处理,降低枝条挥发油含量对控制蒜头果组培褐化的效果值得进一步研究。

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